酶联免疫吸附试验(ELISA)操作要点

　　酶联免疫吸附试验(ELISA)操作要点

　　以下是天正信达生物阐述酶联免疫吸附试验(ELISA)的核心操作要点及注意事项：

　　一、实验前准备

　　材料选择‌

　　优先选用聚苯乙烯96孔板作为固相载体

　　酶标二抗建议选择HRP或AP标记型

　　光敏感试剂(如TMB底物)需避光保存

　　样本处理‌

　　血清样本需避免溶血(红细胞破裂会干扰HRP活性)

　　组织样本建议按1:5(w/v)比例用PBS匀浆后过滤

　　二、关键操作流程

　　包被阶段‌

　　抗原/抗体稀释浓度通常为1-10μg/mL(碳酸盐缓冲液pH9.6)

　　4℃过夜或37℃孵育2小时，确保均匀吸附

　　封闭处理‌

　　推荐使用5% BSA或脱脂奶粉溶液，200μL/孔封闭1-2小时

　　封闭后需用PBST(含0.05% Tween-20)洗涤3-5次

　　加样规范‌

　　加样时需对准孔底，避免气泡或液体溅出

　　样本建议进行梯度稀释(如2倍系列稀释)

　　孵育条件‌

　　严格控制温度(室温或37℃)及时间(1-2小时)

　　建议使用轨道震荡仪(500±50rpm)提高结合效率

　　显色与终止‌

　　TMB底物反应时间控制在5-30分钟(观察显色强度)

　　HRP系统终止使用2M硫酸，AP系统用NaOH

　　三、质量控制要点

　　项目‌ ‌要求‌

　　洗涤‌ 每次注满200μL洗涤液，拍干

　　对照组‌ 必须包含阴性/阳性对照及空白孔

　　数据读取‌ 显色后15分钟内完成OD值检测

　　注：实验全程需佩戴手套，移液枪需定期校准

　　以上资料仅供参考，具体请咨询技术老师或供应商。

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