ELISA实验基本原理与必要试剂

　　ELISA实验基本原理与必要试剂

　　一、ELISA的基本原理

　　ELISA(酶联免疫吸附试验)是一种基于 抗原-抗体特异性结合 和 酶催化显色 的检测技术。其核心原理包括：

　　固相包被：将抗原或抗体固定在微孔板(聚苯乙烯材质)表面。

　　特异性结合：待测样本中的目标分子(抗原/抗体)与包被的抗体/抗原结合。

　　酶标记信号放大：通过酶标记的二抗或抗原与复合物结合，加入底物后产生显色反应。

　　信号检测：用酶标仪测定吸光度(OD值)，定量分析目标物浓度。

　　二、ELISA的四种主要类型及原理

　　类型原理适用对象

　　直接ELISA酶标一抗直接与抗原结合(一步法)快速检测(如病毒抗原筛查)

　　间接ELISA一抗结合抗原，酶标二抗结合一抗(信号放大)抗体检测(如血清IgG)

　　夹心ELISA包被抗体捕获抗原，酶标二抗结合抗原另一表位(双抗体夹心)大分子抗原(如细胞因子、蛋白质)

　　竞争ELISA样本抗原与酶标抗原竞争结合抗体(OD值与样本浓度负相关)小分子(如激素、药物)

　　三、ELISA实验的必要试剂

　　1. 核心试剂

　　试剂作用常见示例

　　包被抗体/抗原固定在微孔板表面，捕获目标分子抗人IL-6抗体、BSA-偶联抗原

　　封闭剂封闭未结合位点，减少非特异性吸附5%脱脂奶粉、1-3% BSA

　　检测抗体(一抗)与目标分子结合(间接法/夹心法需此步骤)抗目标蛋白单克隆抗体

　　酶标二抗携带酶标记，与一抗结合(信号放大)HRP-抗小鼠IgG、AP-抗兔IgG

　　酶底物被酶催化产生显色/荧光信号TMB(显蓝)、OPD(显橙)

　　终止液终止酶反应，稳定信号2M H₂SO₄(TMB终止后变黄)

　　洗涤缓冲液去除未结合物，降低背景PBS + 0.05% Tween-20(PBST)

　　2. 辅助试剂

　　样本稀释液：PBS或专用稀释液(含蛋白稳定剂)。

　　标准品：已知浓度的抗原/抗体，用于绘制标准曲线。

　　质控品：阳性/阴性对照，验证实验有效性。

　　四、关键试剂的作用与选择

　　包被缓冲液

　　常用：碳酸盐缓冲液(pH 9.6)或PBS(pH 7.4)。

　　作用：优化蛋白质吸附效率(碱性环境增强疏水相互作用)。

　　酶标记物

　　HRP(辣根过氧化物酶)：底物为TMB/OPD。

　　AP(碱性磷酸酶)：底物为pNPP(显黄色)，适合高灵敏度检测。

　　封闭剂选择

　　BSA：通用型，成本较高。

　　脱脂奶粉：经济，但可能含微量IgG(不适合抗体检测)。

　　五、实验流程示例(夹心ELISA)

　　包被：用包被抗体(1-10 μg/mL)4℃过夜。

　　封闭：1-3% BSA 37℃封闭1小时。

　　加样本：加入待测样本/标准品，37℃孵育1小时。

　　加检测抗体：生物素化抗体孵育1小时。

　　加酶标物：HRP-链霉亲和素孵育30分钟。

　　显色：TMB显色10-15分钟，2M H₂SO₄终止。

　　检测：酶标仪读取450 nm OD值。

　　六、常见问题与试剂优化

　　高背景：增加封闭时间或更换封闭剂(如改用酪蛋白)。

　　信号弱：提高抗体浓度或延长孵育时间。

　　标准曲线异常：检查标准品稀释是否准确，避免反复冻融。

　　七、总结

　　ELISA的核心是通过 抗原-抗体-酶标记系统 实现信号放大与检测。实验成功的关键在于：

　　试剂匹配性(抗体对、酶-底物系统)。

　　严格质控(标准曲线R²>0.99，CV<10%)。

　　操作标准化(温控、洗涤性)。

　　注：以上资料仅供参考，不作为实验依据，如需完整版产品信息请咨询品牌供应商或技术老师。

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