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ELISA(酶联免疫吸附试验)是一种高灵敏、高特异的免疫检测技术，广泛应用于医学诊断、生物研究和食品安全检测等领域。ELISA试剂盒通常包含预包被板、检测抗体、酶标记物、底物、终止液等组分，其测定方法主要包括直接法、间接法、夹心法(双抗体夹心)和竞争法。
1. ELISA试剂盒的常见测定方法
(1) 双抗体夹心法(Sandwich ELISA)
适用对象：大分子抗原(如蛋白质、细胞因子、病毒颗粒)
原理：
包被抗体：微孔板预包被捕获抗体(Capture Antibody)。
加样本：待测抗原与捕获抗体结合。
加检测抗体：酶标记的检测抗体(Detection Antibody)与抗原另一表位结合。
显色：加入底物(如TMB)，酶催化显色，OD值测定。
特点：
高灵敏度(可检测pg/mL级)。
需抗原至少有两个抗体结合位点(不适用于小分子)。
(2) 间接法(Indirect ELISA)
适用对象：抗体检测(如血清抗体、疫苗效价评估)
原理：
包被抗原：微孔板包被已知抗原。
加样本：待测抗体(如血清)与抗原结合。
加二抗：酶标记的二抗(如HRP-抗人IgG)与一抗结合。
显色：加入底物，测定OD值。
特点：
适用于多种抗体检测(只需更换包被抗原)。
信号放大效果强(因二抗可结合多个酶分子)。
(3) 竞争法(Competitive ELISA)
适用对象：小分子抗原(如激素、药物、毒素)
原理：
包被抗原/抗体：微孔板包被抗原或抗体。
加样本+酶标抗原：待测样本与酶标抗原竞争结合抗体。
显色：样本中抗原越多，酶标抗原结合越少，信号越低(负相关)。
特点：
适用于半抗原(如农药残留)。
结果需反向解读(OD值越低，样本浓度越高)。
(4) 直接法(Direct ELISA)
适用对象：快速检测(如病毒抗原筛查)
原理：
包被抗体：微孔板包被捕获抗体。
加样本：待测抗原结合。
加酶标抗体：直接使用酶标记的检测抗体(无二抗步骤)。
显色：测定OD值。
特点：
步骤简单，但灵敏度较低。
适用于高浓度抗原检测。
2. ELISA实验的关键要求
(1) 样本处理要求
血清/血浆：避免溶血(血红蛋白会干扰显色)，离心后取上清。
细胞培养上清：去除细胞碎片(离心10,000 ×g，5分钟)。
组织匀浆：需裂解、离心，取澄清上清。
保存条件：短期4°C，长期-80°C(避免反复冻融)。
(2) 试剂准备要求
平衡至室温：所有试剂使用前需平衡(避免冷凝水影响浓度)。
避免污染：不同试剂使用专用枪头。
稀释比例：严格按说明书操作(如1:100稀释血清)。
(3) 反应条件控制
孵育时间：37°C 1小时或4°C过夜(延长孵育可提高灵敏度)。
洗涤次数：通常3-5次(残留洗涤液会导致高背景)。
显色时间：TMB显色10-30分钟(过长会饱和)。
(4) 仪器要求
酶标仪：选择适配波长(如TMB→450 nm，OPD→492 nm)。
移液器校准：确保加样精度(误差<5%)。
3. 常见问题及解决方案
问题可能原因解决方案
信号弱/无信号抗体失效、孵育时间不足更换抗体，延长孵育时间
背景高封闭不充分、洗涤不增加封闭剂浓度，加强洗涤(如5次)
孔间差异大加样不均、气泡干扰使用多通道移液器，离心去除气泡
标准曲线线性差稀释错误、酶标板边缘效应重新稀释样本，避免使用边缘孔
4. 结果分析与数据解读
标准曲线：用已知浓度标准品绘制(通常4-5参数拟合)。
计算浓度：根据样本OD值代入曲线方程。
质量控制：
空白孔(Blank)：仅加缓冲液，OD应接近0。
阴性对照(NC)：应低于Cut-off值。
阳性对照(PC)：应在预期范围内。
5. 总结
选择合适方法：大分子用夹心法，小分子用竞争法，抗体检测用间接法。
严格操作流程：控制孵育时间、温度、洗涤次数。
数据验证：每次实验需包含标准曲线和对照。
注：以上资料仅供参考，不作为实验依据，如需完整版产品信息请咨询品牌供应商或技术老师。
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