ELISA实验总是遇到这些问题，怎么办呀?

　　ELISA实验全流程问题排查手册

　　我们将问题分为三大类：① 信号问题、② 背景问题、③ 标准曲线/数据问题。

　　一、 信号问题

　　1. 无信号或信号太弱

　　可能原因及解决方案：

　　试剂问题：

　　抗体失活或错加漏加： 确认一抗、二抗或检测抗体(间接法)是否有效。检查抗体保质期，并确保添加了正确的抗体。每次实验前，短暂离心抗体管，确保试剂全部集中在管底。

　　酶失活： 检查HRP等酶标记物是否因保存不当(如反复冻融、接触叠氮钠)而失活。

　　底物失效： TMB底物应无色透明，若已变蓝则说明失效。需避光保存，现用现配。

　　样本问题：

　　目标蛋白浓度过低： 样本中待测物含量低于检测下限。可尝试浓缩样本或换用更高灵敏度的ELISA试剂盒。

　　样本保存不当： 反复冻融或长期保存于-20℃(而非-80℃)可能导致蛋白降解。确保样本分装保存，避免反复冻融。

　　样本基质干扰： 血清、血浆中的干扰物质(如溶血、脂血)可能影响。可适当稀释样本或对样本进行预处理(如高速离心去除沉淀)。

　　操作问题：

　　孵育时间/温度不足： 严格遵循说明书推荐的孵育时间和温度(通常是37℃ 1小时或4℃过夜)。

　　洗板过于剧烈： 洗板次数过多或冲力过猛，将包埋的抗原或结合的抗体洗脱。遵循说明书的洗涤次数和程序，保持洗板机喷嘴通畅，手工洗板时动作要轻柔。

　　封板膜不严： 孵育时蒸发导致边缘孔变干，有效浓度升高，而中心孔浓度正常，出现“边缘效应"。确保使用高质量的封板膜，并密封孔板。

　　移液误差： 定期校准移液器，确保加样体积准确。吸取粘稠液体(如血清)时最好使用反向吸液法。

　　2. 信号过强(超出标准曲线最高点)

　　可能原因及解决方案：

　　样本浓度过高： 这是最常见的原因。必须对样本进行预实验摸索稀释倍数! 找到一个使OD值落在标准曲线中段的稀释度。

　　孵育时间过长或温度过高： 严格计时，避免过度孵育。

　　酶标二抗浓度过高： 如果是自己组建的ELISA体系，需滴定优化二抗浓度。

　　底物显色时间过长： TMB显色反应需及时终止(加终止液)。一旦标准曲线最高点颜色足够深，应立即终止。

　　二、 背景问题

　　现象： 阴性对照、空白孔也有较高的吸光度值。

　　可能原因及解决方案：

　　洗涤不充分： 这是高背景的首要元凶!确保洗涤缓冲液配制正确(如盐离子浓度)，洗涤次数和体积要足够，每次洗涤后都要在吸水纸上拍干残留液体。

　　封闭不净：

　　更换封闭剂(常用BSA、脱脂奶粉、血清等)，找到适合您体系的封闭液。

　　增加封闭液浓度或延长封闭时间。

　　非特异性结合：

　　抗体交叉反应： 确保使用的一抗和二抗特异性好，且种属匹配。例如，检测小鼠样本，二抗应为抗小鼠的，且一抗不能来源于小鼠。

　　抗体浓度过高： 滴定优化一抗和二抗的工作浓度。

　　试剂污染： 所有试剂和容器都要确保干净，避免交叉污染。

　　底物显色时间过长： 同“信号过强"原因。

　　酶标板问题： 使用了非ELISA专用的极板，吸附能力不均一。

　　三、 标准曲线与数据问题

　　1. 标准曲线不佳(线性差/R²值低)

　　标准品问题：

　　标准品复溶不当：未溶解或混匀不充分。复溶前先离心，加入稀释液后轻柔地吹打或涡旋混匀，避免起泡。

　　标准品反复冻融：必须分装保存，每支只用一次。

　　稀释错误：进行倍比稀释时，每步都要换新枪头，并充分混匀。

　　移液误差： 标准曲线的准确性极度依赖精确的移液。务必使用校准过的移液器和高质量的枪头。

　　孵育时间不一致： 标准品孔和样本孔应同时加样、孵育和显色，以保证反应条件一致。

　　2. 重复性差(孔间差异大)

　　操作不一致： 不同操作者或同一次实验的不同时间点，手法不一致。尽量由同一人完成全部操作。

　　洗板不均： 洗板机堵塞导致某些孔洗涤不充分/过于剧烈。每次实验前检查洗板机所有通道是否通畅。

　　移液误差： 同上，确保加样精确。

　　板底不洁： 读板前，用无尘纸仔细擦拭板底，去除指纹、水渍或灰尘。

　　通用黄金法则与建议

　　尊重说明书： 实验时，严格遵循试剂盒说明书的每一步，不要随意更改流程、时间和温度。

　　设立对照： 每一次实验都必须包含：

　　空白孔： 只有底物和终止液，用于调零。

　　阴性对照：不含目标蛋白的样本基质，用于评估背景。

　　阳性对照 ：已知浓度的标准品或样本，用于验证实验有效性。

　　精心准备：

　　提前规划： 将所有试剂从冰箱取出，平衡至室温(除非说明书要求低温操作)，减少温度带来的误差。

　　充分混匀： 所有液体试剂使用前都轻轻摇匀。

　　“预实验"摸索： 对于未知浓度的样本，一定要做梯度稀释预实验，找到合适的稀释倍数。

　　做好记录： 详细记录每一批试剂的批号、实验日期、操作人员、任何与说明书不一致的细节等，便于出了问题追溯原因。

　　总结一下，当您遇到问题时，可以按照以下步骤排查：

　　回顾实验记录，确认操作无误。

　　检查试剂：是否在效期内?是否正确保存?是否漏加?

　　重点检查洗涤和孵育步骤，这两个是问题的重灾区。

　　分析标准曲线：如果标准曲线很好，问题很可能出在样本;如果标准曲线也很差，问题则出在公共环节(如试剂、操作、洗板等)。

　　注：以上仅供参考，不作为实际数据，实验需严格遵循说明或咨询技术老师。 Elisa试剂盒

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