科研检测pcr试剂盒使用方法

　　科研检测pcr试剂盒使用方法

　　PCR试剂盒使用方法

　　1. ‌实验前准备‌

　　环境消毒‌：实验室需提前用紫外线照射30分钟，确保无菌环境‌。

　　工具准备‌：冰盒、离心机、移液器、灭菌PCR管等需提前备齐，操作时佩戴手套和口罩‌。

　　试剂检查‌：确认试剂盒在有效期内，核对组分是否齐全(如2×Taq Mix、引物、dNTPs等)‌。

　　2. ‌反应体系配制‌

　　试剂解冻‌：除酶组分外，其他试剂室温静置10分钟融化;酶制剂需冰上短暂解冻后轻弹混匀‌。

　　加样顺序‌(以25μL体系为例)：

　　2×Taq Mix 12.5μL

　　引物各1μL(多重PCR时总量≤3μL)

　　模板DNA 2μL(浓度50-200ng/μL，A260/A280=1.8-2.0)

　　补足ddH₂O至25μL‌。

　　注意事项‌：配制过程需在冰上进行，避免反复冻融试剂‌。

　　3. ‌PCR程序设置‌

　　预变性‌：95℃ 5分钟，确保DNA双链分离‌。

　　循环参数‌：

　　变性：95℃ 30秒

　　退火：50-65℃(根据引物Tm值调整，建议比Tm低3-5℃)30秒

　　延伸：72℃(1kb/min计算时间)‌。

　　循环次数‌：25-35次(高GC模板可增至40次)，最终延伸72℃ 5分钟‌。

　　4. ‌结果检测‌

　　电泳分析‌：取10-20μL产物，1%琼脂糖凝胶电泳(40-60V，30-40分钟)，与DNA Marker对比条带大小‌。

　　对照设置‌：必须包含阴性对照(无模板)和阳性对照(已知模板)‌。

　　5. ‌常见问题处理‌

　　无扩增产物‌：检查引物特异性(BLAST验证)、模板质量或稀释模板重试‌。

　　非特异性条带‌：优化退火温度或使用热启动酶‌。

　　注意事项

　　引物设计‌：长度15-28碱基，GC含量40%-60%，避免3'端连续G/C‌。

　　酶选择‌：高GC模板建议使用热启动酶(如Taq HS)‌。

　　污染控制‌：不同批次试剂需测试，移液枪定期校准‌。

　　注：以上仅供参考，不作为实际数据，实验需严格遵循说明或咨询技术老师。

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