荧光定量PCR试剂盒在实验过程有哪些

    荧光定量PCR试剂盒在实验过程有哪些

    荧光定量PCR试剂盒实验过程：

    一、试剂准备

    1.DNA模板

    2．对应目的基因的特异引物（在PCR反应中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制，而不能从无到有，凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根据你的模板链设计。因此，扩增不同的基因需要设计不同的引物）

    3．10×PCRBuffer

    4．2mMdNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

    5．Taq酶

    二、注意事项

    １．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。设立一个的PCR实验室。

    ２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。

    ３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。

    ４．PCR试剂配制应使用zui高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。

    ５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。

    ６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。

    ７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。

    三、操作步骤

    1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。

    2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃40s→58℃30s→72℃60s，循环30-35次，zui后在72℃保温7min。

    3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。

    4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μlLuFang进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。

    注意：以上仅供参考，不作为实际数据，实验需严格遵循说明或咨询技术老师。

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