ELISA操作流程及技术要点

　　ELISA操作流程及技术要点

　　一、实验前准备

　　试剂与耗材‌：预包被酶标板、生物素化检测抗体、标准品、显色液(TMB)、终止液、浓缩洗涤液等‌。

　　样本处理‌：血清、血浆等样本需避免溶血和反复冻融，细胞培养上清需离心去除杂质‌。

　　仪器校准‌：确保酶标仪波长(如450nm)和移液器精度已校准‌。

　　二、标准操作步骤

　　加样与孵育‌：

　　每孔加入50μl标准品或待测样本，再加入50μl抗体对混合液‌。

　　封板后37℃孵育45分钟，避免蒸发导致“花板"‌。

　　洗涤‌：

　　用300μl洗液清洗3次，每次静置30秒，去除未结合物‌。

　　显色与终止‌：

　　加入100μl TMB底物，避光孵育10分钟‌。

　　加入50μl终止液，30分钟内测定OD值‌。

　　三、技术要点

　　加样精度‌：使用校准移液器，避免气泡和交叉污染‌。

　　温育控制‌：严格保持37℃±0.5℃，封板膜需严密‌。

　　质控措施‌：

　　设置阴性/阳性对照，板内变异系数(CV)应<5%‌。

　　高浓度样本需稀释，避免“钩状效应"导致假阴性‌。

　　四、常见问题处理

　　高背景‌：优化封闭条件(延长封闭时间)、调整抗体浓度‌。

　　信号缺失‌：检查试剂活性、孵育时间及温度‌。

　　注：以上仅供参考，不作为实际数据，实验需严格遵循说明或咨询技术老师。

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