ELISA试剂盒细胞培养清处理方法汇总

　　ELISA试剂盒细胞培养清处理方法汇总

　　ELISA试剂盒中，细胞培养上清的处理方式需根据检测目标是‌分泌性蛋白‌还是‌细胞内成分‌区分操作，以下是具体方法汇总及注意事项，可参考：

　　一、检测分泌性成分

　　该方法适用于检测细胞分泌到培养基中的目标蛋白，操作步骤如下：

　　确认细胞密度：待贴壁/悬浮细胞密度达到‌60%~90%‌时，即可进行样本采集。

　　收集上清：吸取适量细胞培养上清到无菌离心管中，建议采集体积不小于500μL。

　　离心除杂：在‌2℃~8℃条件下‌，以对应参数离心去除细胞碎片和杂质：

　　常规方案：1000×g离心20分钟

　　短时间方案：2500rpm离心5~10分钟

　　其他方案：3000转离心10分钟

　　转移分装：将澄清上清转移至新离心管，弃掉底部沉淀;按单次使用量分装，避免反复冻融。

　　检测保存：取适量上清直接进行ELISA检测，剩余样本-20℃或-80℃冻存;若保存后出现沉淀，使用前需再次离心去除沉淀。

　　二、检测细胞内成分

　　若目标蛋白存在于细胞内，需先收集细胞再破碎提取上清，操作步骤如下：

　　收集细胞：

　　贴壁细胞‌：吸走原有培养基，用预冷PBS清洗3次，加入胰蛋白酶消化后，4℃ 2500rpm离心5~10分钟，弃上清留细胞沉淀。

　　悬浮细胞‌：直接将培养基和细胞转移离心管，4℃ 2500rpm离心5~10分钟，弃上清留细胞沉淀。

　　细胞破碎：

　　向细胞沉淀中加入含蛋白酶抑制剂(PMSF终浓度1mmol/L)的裂解液：一般每10^6个细胞加入150~250μL中强度RIPA裂解液(不推荐含高浓度NP-40、Triton X-100或DTT的裂解液，会抑制抗原抗体反应)，冰上裂解30~60分钟，也可配合超声破碎：功率150~300W，裂解1~2秒间歇20~30秒，重复3~5个循环。

　　离心取上清：4℃条件下10000rpm离心10分钟，上清即为待测样本。

　　检测保存：立即分装，可直接检测或-80℃冻存。

　　三、通用注意事项

　　蛋白浓度测定：‌ 细胞培养基中含有胎牛血清等杂蛋白，不建议用BCA法测定总蛋白浓度，会导致结果偏差。

　　保存禁忌：‌ 必须分装冻存，禁止反复冻融样本，会导致蛋白降解，影响检测准确性;-20℃可保存1个月，-80℃可保存3个月以上。

　　杂质处理：‌ 冻存样本融化后若出现沉淀，必须再次离心去除沉淀再进行检测，避免杂质干扰结果。

　　若实验需要酸化处理样本：100μL细胞培养上清+20μL 1mol/L HCl，轻微混合后室温孵育10分钟，再加入20μL 1.2N NaOH/0.5M HEPES中和后即可检测。

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