PCR实验常见问题及解决方案

　　PCR实验常见问题及解决方案

　　以下是天正信达PCR实验常见问题及解决方案的系统性总结：

　　一、扩增失败类问题

　　无扩增条带‌

　　酶失活：更换新酶或不同品牌酶制剂

　　模板问题：

　　• 含甲酸等杂质(石蜡包埋样本需特殊处理)

　　• 浓度不足(建议梯度稀释验证)

　　温度异常：校准PCR仪温度，变性温度建议93-94℃/1min

　　假阴性结果‌

　　引物降解：PAGE电泳验证引物完整性

　　抑制物干扰：纯化模板或改用柱式提取试剂盒

　　退火温度过高：梯度PCR优化(推荐55-65℃范围)

　　二、产物异常类问题

　　现象 主要原因 解决方案

　　非特异性条带 引物二聚体/Mg²⁺浓度过高 降低引物量至0.1-1μM，调整Mg²⁺至1.5-2mM

　　拖尾/弥散 循环数过多/dNTP浓度偏高 减少循环至30-35次，dNTP浓度控制在200μM以下

　　产物量不足 延伸时间过短/模板量低 按1kb/min延长延伸时间，增加模板至50-100ng

　　三、污染与质控

　　假阳性污染‌

　　操作规范：

　　• 分装试剂避免反复冻融

　　• 使用带滤芯枪头

　　环境控制：前/后PCR区域物理隔离

　　数字PCR优化‌

　　低频突变检测：结合预扩增技术可将灵敏度提升至0.1ppm

　　四、关键参数优化

　　引物设计‌：

　　• 长度18-27bp，GC含量40-60%

　　• 避免3'端互补(BLAST验证特异性)

　　循环参数‌：

　　变性94℃/30s → 退火(梯度优化)→ 延伸72℃/1kb/min

　　注：白色孔板专用膜可提升低浓度样本检测信号强度

　　注：以上资料仅供参考，如需完整产品说明，建议联系供应商获取最新版本.

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