如何提高ELISA灵敏度?抗原抗体反应条件优化指南

　　如何提高ELISA灵敏度?抗原抗体反应条件优化指南

　　以下是天正信达对提高ELISA灵敏度及优化抗原抗体反应条件的系统性指南，综合实验设计与操作关键点：

　　一、抗体与抗原优化

　　抗体选择‌

　　优先使用高亲和力单克隆抗体(减少交叉反应)或高特异性多克隆抗体(增加表位覆盖)。

　　通过棋盘滴定法确定捕获抗体和检测抗体的最佳工作浓度(如10 μg/ml至1 μg/ml梯度测试)。

　　抗原处理‌

　　包被抗原时采用碳酸盐缓冲液(pH 9.6)增强吸附效率，脂质抗原需使用疏水表面及酒精溶解。

　　避免抗原表位遮蔽：通过稀释或变性处理暴露隐藏表位。

　　二、反应条件控制

　　温育参数‌

　　37℃孵育时需水浴或湿盒维持湿度均一，边缘孔填充缓冲液减少蒸发差异。

　　延长孵育时间(如1小时→2小时)可提高结合率，但需平衡酶活性损失风险。

　　pH与离子强度‌

　　抗原抗体反应最适pH为7.2-7.4，补体参与时需严格控制在7.2-7.4。

　　洗涤液中添加0.05% Tween-20减少非特异性结合，但浓度过高可能导致复合物解离。

　　三、信号放大与背景抑制

　　酶联系统优化‌

　　选用HRP或ALP标记二抗，搭配高灵敏度底物(如TMB显色液)。

　　引入生物素-亲和素系统(BAS)放大信号，灵敏度可提升5-10倍。

　　封闭策略‌

　　5% BSA或脱脂奶粉封闭1小时，若背景仍高可测试无蛋白封闭剂(如聚乙烯醇)。

　　封闭后增加洗涤次数(3-5次)去除未结合物质。

　　四、检测形式选择

　　ELISA类型‌ ‌适用场景‌ ‌灵敏度对比‌

　　直接法‌ 快速筛查(低复杂度样本) 低(无信号放大)

　　夹心法‌ 大分子抗原(需双表位) 最高(双重特异性)

　　竞争法‌ 小分子/单表位抗原 中等(信号与浓度负相关)

　　五、样本前处理

　　血清样本建议56℃ 30分钟灭活补体，避免假阳性。

　　复杂基质(如组织匀浆)需离心过滤去除杂质，或稀释至线性范围内。

　　通过上述综合优化，ELISA灵敏度可显著提升，同时需通过标准曲线验证(R²≥0.99)确保数据可靠性。

　　注：以上资料仅供参考，不作为实际标准，具体请咨询技术老师。

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