ELISA夹心法实验步骤和注意事项

　　ELISA夹心法实验步骤和注意事项

　　以下是天正信达ELISA夹心法实验步骤及注意事项的详细说明：

　　一、实验步骤‌

　　抗体包被‌

　　用pH9.5碳酸盐缓冲液稀释捕获抗体至1-10μg/ml，每孔加入100μl，4℃包被过夜(或37℃ 2小时)。

　　弃去孔内液体，用洗涤液(含0.1%吐温的PBS)洗板3次，每次3分钟，拍干。

　　封闭‌

　　加入3% BSA或5%脱脂牛奶的封闭液200μl/孔，37℃孵育1小时，封闭非特异性结合位点。

　　洗板3次，方法同前。

　　加样与孵育‌

　　加入待测样本或标准品100μl/孔，37℃孵育1小时(复杂样本可延长至2小时)。

　　设置空白孔、阴性对照孔和阳性对照孔。

　　酶标抗体结合‌

　　洗板后加入HRP标记的检测抗体100μl/孔，37℃孵育1小时。

　　洗板5次，去除未结合抗体。

　　显色与终止‌

　　加入TMB底物溶液100μl/孔，避光反应15-30分钟(观察显色程度)。

　　加入50μl 2Mls终止反应，颜色由蓝变黄。

　　检测‌

　　终止后15分钟内用酶标仪测定450nm处OD值(参考波长630nm)。

　　二、关键注意事项‌

　　样本处理‌

　　血清样本需离心去除纤维蛋白，避免溶血;组织匀浆需充分裂解后离心取上清。

　　NaN3会抑制HRP活性，避免使用含NaN3的样本或缓冲液。

　　温度控制‌

　　所有试剂使用前需平衡至室温(20-25℃)，避免温度差异导致反应速率不均。

　　孵育时用不干胶密封板孔，防止蒸发。

　　洗涤操作‌

　　手工洗板需垂直拍板，避免交叉污染;自动洗板机需检查洗液管路是否堵塞。

　　洗涤后立即加下一步试剂，避免孔板干燥。

　　质量控制‌

　　阳性对照OD值应≥0.8，阴性对照OD值≤0.2，否则实验无效。

　　建议做双复孔，减少操作误差。

　　试剂保存‌

　　未开封试剂盒2-8℃保存;浓缩洗涤液结晶需37℃溶解后使用。

　　TMB底物需避光保存，现配现用。

　　三、常见问题解决‌

　　高本底值‌：检查封闭是否充分，可延长封闭时间或更换封闭剂(如改用5%脱脂牛奶)。

　　显色过弱‌：确认酶标抗体活性及孵育时间，避免显色底物失效。

　　孔间差异大‌：校准移液器，加样时避免气泡或孔壁残留。

　　如需具体试剂盒参数，请参照产品说明书。

　　注：以上资料仅供参考，不作为实际标准，具体请咨询技术老师。

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