单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)活性测定试剂盒(微量法)资料

　　产品信息

　　产品名称测定方法产品编号规格

　　单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)活性测定试剂盒微量法0管/96样

　　正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定

　　测定意义

　　MDHAR催化MDHA还原生成AsA，在抗坏血酸氧化还原代谢中具有重要作用。

　　测定原理

　　MDHAR 催化 NADH 还原MDHA 生成 AsA和NAD+，NADH在340 nm有特征吸收峰，但是NAD+没有。通过测定340 nm光吸收下降速率，来计算出MDHAR活性。

　　实验中所需仪器及设备

　　研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液枪和双蒸水

　　试剂组成和配置

　　试剂一：液体100mL×1瓶，4℃保存。

　　试剂二：液体20mL×1瓶，室温保存。

　　试剂三：粉剂×1瓶(棕色)，4℃保存。临用前加入3 mL蒸馏水充分溶解。

　　试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入2.5 mL蒸馏水充分溶解。

　　试剂五：液体15μL×1瓶，4℃保存。临用前加3 mL试剂二充分溶解。

　　粗酶液提取

　　组织：按照组织质量(g)：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例(建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

　　. 细菌、真菌：按照细胞数量(104个)：试剂一体积(mL)为500~1000：1的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一)，冰浴超声波破碎细胞(功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min);8000g ，4℃离心20min，取上清液置冰上混匀待测。

　　血清等液体：直接测定。

　　MDHAR测定操作

　　1.分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到340 nm，蒸馏水调零。

　　2.试剂二在25℃水浴锅中预热30 min。

　　3.依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL试剂三、20μL试剂四、20μL试剂五和120μL试剂二，最后加入20μL上清液，迅速混匀后于340nm比色，记录30s和150s的吸光值30s和150s的吸光值A1和A2，△A=A1-A2。

　　MDHAR活性计算公式

　　a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

　　(1). 按蛋白浓度计算

　　MDHAR活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。

　　MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V反总×109]÷(Cpr×V样)÷T= 804×△A ÷Cpr

　　(2). 按样本质量计算

　　MDHAR活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化1nmol NADH 为1U。

　　MDHAR (nmol/min /g 鲜重) = △A÷ε÷d×V反总×109]÷(W×V样÷V样总)÷T= 804×△A ÷W

　　(3)按细胞数量计算

　　MDHAR活性单位定义：25℃中每104个细胞每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。

　　MDHAR (nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V反总×109÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T= 804×△A ÷ 细胞数量

　　(4)按液体体积计算

　　MDHAR活性单位定义：25℃中每毫升液体每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。

　　MDHAR (nmol/min /mL) = △A÷ε÷d×V反总×109÷V样)÷T= 804×△A

　　ε：NADH摩尔消光系数，6220 L/mol/cm;d：比色皿光径，1cm;V反总：反应体系总体积，0.2mL=2×10-4L;V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL;V样总：提取液体积，1 mL;Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，蛋白质浓度需要另外测定，建议使用本公司蛋白质含量BCA试剂盒;W ：样品质量;T：反应时间，2min。

　　b.使用96孔板测定的计算公式如下：

　　(1). 按蛋白浓度计算

　　MDHAR活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。

　　MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V反总×109]÷(Cpr×V样)÷T= 1608×△A ÷Cpr

　　(2). 按样本质量计算

　　MDHAR活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化1nmol NADH 为1U。

　　MDHAR (nmol/min /g 鲜重) = △A÷ε÷d×V反总×109]÷(W×V样÷V样总)÷T= 1608×△A ÷W

　　(3)按细胞数量计算

　　MDHAR活性单位定义：25℃中每104个细胞每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。

　　MDHAR (nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V反总×109÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T= 1608×△A ÷ 细胞数量

　　(4)按液体体积计算

　　MDHAR活性单位定义：25℃中每毫升液体每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。

　　MDHAR (nmol/min /mL) = △A÷ε÷d×V反总×109÷V样)÷T=1608×△A

　　ε：NADH摩尔消光系数，6220 L/mol/cm;d：96孔板光径，0.5cm;V反总：反应体系总体积，0.2mL=2×10-4L;V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL;V样总：提取液体积，1 mL;Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，蛋白质浓度需要另外测定，建议使用本公司蛋白质含量BCA试剂盒;W ：样品质量;T：反应时间，2min。

　　注意事项

　　临用前配制的试剂未使用完的4℃保存，3天内使用完。

　　本产品仅作科研用途!

　　注：以上资料仅供参考，不作为实验数据，具体请咨询品牌供应商或技术老师;

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