竞争ELISA测抗体亲和力实验流程

　　竞争ELISA测抗体亲和力实验流程

　　一、实验原理

　　竞争ELISA通过待测抗体与酶标抗原竞争结合固相抗原，显色信号强度与抗体浓度成反比，适用于小分子抗原或半抗原的检测‌。

　　二、实验步骤

　　试剂与样本准备‌

　　标准品倍比稀释(如S1-S7)，待测样本平衡至室温‌。

　　特异性抗体稀释为工作液(如1:100)，确保仅识别目标抗原‌。

　　竞争反应‌

　　将样本与抗体工作液加入包被抗原的酶标板，37℃孵育1小时‌。

　　洗涤3次去除未结合物质(PBS+0.05% Tween-20)‌。

　　酶标二抗孵育‌

　　加入酶标二抗(如HRP标记)，37℃孵育50分钟，洗涤5次‌。

　　显色与终止‌

　　加入TMB底物避光反应20分钟，终止液终止后5分钟内读数(450nm)‌。

　　数据分析‌

　　绘制标准曲线(抗体浓度 vs. OD值)，计算待测样本的抗体亲和力(IC50)‌。

　　三、关键注意事项

　　洗涤

　　洗涤不充分会导致高背景信号，建议洗板5次以上‌。

　　孵育条件控制‌

　　温度波动(如±1℃)或时间偏差(如±5分钟)均影响结果稳定性‌。

　　试剂时效性‌

　　酶标抗体工作液需现配现用(15分钟内使用)，避免活性下降‌。

　　样本预处理‌

　　高浓度样本需预稀释，避免“钩状效应"导致假阴性‌。

　　四、常见问题与解决

　　信号弱‌：检查抗体效价、底物活性及孵育时间‌。

　　标准曲线异常‌：验证标准品浓度准确性及稀释操作规范性‌。

　　注：以上仅供参考，不作为实际数据，实验需严格遵循说明或咨询技术老师。

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