RNA逆转录试剂盒操作步骤及实验原理

　　RNA逆转录试剂盒操作步骤及实验原理

　　RNA逆转录实验原理

　　RNA逆转录是通过逆转录酶将RNA模板(如mRNA)转化为互补DNA(cDNA)的过程，其核心原理是逆转录酶以RNA为模板，在引物(如Oligo dT或随机引物)引导下合成cDNA链‌。该技术广泛应用于基因表达分析、病毒检测等领域，其关键步骤包括：

　　引物结合‌：Oligo dT引物结合mRNA的Poly(A)尾，或随机引物结合RNA任意区域‌。

　　cDNA合成‌：逆转录酶在42-50℃下催化dNTPs聚合，形成cDNA链‌。

　　酶失活‌：高温(85℃)终止反应，防止酶活性干扰后续实验‌。

　　试剂盒操作步骤

　　以常见试剂盒为例，操作流程如下：

　　1. ‌RNA准备‌

　　质量检测‌：通过电泳确认RNA完整性(28S/18S条带比例2:1)‌。

　　去基因组DNA‌：使用DNase处理RNA，避免gDNA污染‌。

　　2. ‌反应体系配制‌

　　冰上操作‌：防止RNA降解‌。

　　加样顺序‌：

　　加入RNA模板(100pg-2μg)‌。

　　加入逆转录酶、dNTPs及缓冲液(比例参考试剂盒说明)‌。

　　轻弹混匀后瞬离，避免气泡‌。

　　3. ‌逆转录程序‌

　　退火‌：25℃孵育5分钟(引物结合)‌。

　　延伸‌：42℃反应15-60分钟(cDNA合成)‌。

　　酶失活‌：85℃加热5分钟终止反应‌。

　　4. ‌产物保存‌

　　cDNA可短期保存于-20℃，长期保存于-80℃‌。

　　注意事项

　　RNA质量‌：降解或污染的RNA会导致cDNA产量低‌。

　　引物选择‌：

　　Oligo dT适用于真核mRNA，随机引物适用于原核或降解RNA‌。

　　温度控制‌：复杂RNA(如高GC含量)需65℃预变性5分钟‌。

　　常见问题解决

　　cDNA浓度低‌：检查RNA完整性或增加模板量‌。

　　gDNA污染‌：使用DNase处理或设计跨外显子引物‌。

　　通过上述步骤和原理，可高效完成RNA逆转录实验，为后续PCR或qPCR提供可靠模板‌。

　　注：以上仅供参考，不作为实际数据，实验需严格遵循说明或咨询技术老师。

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