RNA逆转录实验常见问题及解决方案

　　RNA逆转录实验常见问题及解决方案

　　1. ‌RNA模板降解‌

　　问题‌：RNA易被RNase降解，导致cDNA合成失败或产量低。

　　解决方案‌：

　　全程冰上操作，使用RNase-free耗材(如枪头、离心管)‌。

　　加入RNase抑制剂(如RiboLock)保护RNA‌。

　　通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性(28S/18S条带比例应为2:1)‌。

　　2. ‌RNA定量不准确‌

　　问题‌：RNA浓度过高(>5μg)或过低(<100pg)影响逆转录效率。

　　解决方案‌：

　　使用分光光度计(A260/A280=1.8-2.1)或荧光定量仪精确测定浓度‌。

　　避免过量上样，防止高丰度基因优先逆转录导致定量偏差‌。

　　3. ‌基因组DNA(gDNA)污染‌

　　问题‌：残留gDNA干扰qPCR结果，导致假阳性。

　　解决方案‌：

　　使用DNase I处理RNA模板‌。

　　引物设计跨外显子，避免扩增gDNA‌。

　　选择含gDNA去除功能的逆转录试剂盒‌。

　　4. ‌引物选择不当‌

　　问题‌：引物与模板不匹配，导致cDNA合成不完整。

　　解决方案‌：

　　Oligo dT引物‌：适用于真核mRNA(需polyA尾)，但需高质量RNA‌。

　　随机引物‌：适用于原核RNA或降解样本，但产物片段较短‌。

　　混合引物‌：Oligo dT+随机引物组合可提高全长cDNA产量‌。

　　5. ‌RNA二级结构影响‌

　　问题‌：高GC含量或复杂结构阻碍逆转录酶延伸。

　　解决方案‌：

　　65℃预变性5分钟破坏二级结构‌。

　　使用耐高温逆转录酶。

　　6. ‌逆转录酶活性不足‌

　　问题‌：酶失活或效率低导致cDNA合成失败。

　　解决方案‌：

　　选择高保真逆转录酶。

　　优化反应温度(42-50℃)和缓冲体系‌。

　　7. ‌cDNA质量验证失败‌

　　问题‌：无法通过PCR或qPCR检测目标基因。

　　解决方案‌：

　　扩增内参基因(如GAPDH)验证cDNA完整性‌。

　　若内参正常但目的基因无扩增，需检查引物设计或模板质量‌。

　　总结

　　RNA逆转录实验需严格把控RNA质量、引物选择及反应条件。若遇问题，可优先排查模板降解、gDNA污染及酶活性等关键因素‌。

　　注：以上仅供参考，不作为实际数据，实验需严格遵循说明或咨询技术老师。

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