ELISA原理、操作流程及常见问题解决方案
ELISA技术原理与核心机制
ELISA(酶联免疫吸附测定)基于抗原-抗体的特异性结合，通过酶标记放大信号实现目标物质的定性与定量分析。其核心步骤包括：
固相包被：抗原或抗体通过疏水作用吸附于聚苯乙烯微孔板表面。
免疫反应：样本中的目标物与包被物结合，形成固相-抗原-抗体复合物。
信号放大：酶标记的二抗或抗原催化底物(如TMB)显色，显色强度与目标物浓度正相关。
主要ELISA类型及操作流程
1. 双抗体夹心法(检测大分子抗原)
步骤：
包被捕获抗体 → 封闭 → 加样本 → 加酶标检测抗体 → 显色。
需两种抗体(捕获+检测)，避免交叉反应。
适用场景：细胞因子(如IL-6)、病毒抗原(如HBsAg)检测。
2. 竞争法(检测小分子抗原/抗体)
原理：样本目标物与酶标物竞争结合固相抗体，显色信号与目标物浓度负相关。
关键点：适用于激素、药物残留等小分子检测。
3. 间接法(检测抗体)
优势：通过酶标二抗放大信号，灵敏度高于直接法。
注意：需验证抗原纯度，避免假阳性。
常见问题与解决方案
高背景值
原因：封闭不充分或洗涤。
解决：优化封闭液(5%脱脂牛奶+0.05% Tween-20)，增加洗涤次数。
标准曲线不佳
排查：标准品溶解不充分或梯度稀释误差。
建议：使用“八枪头法”减少加样误差，37℃水浴助溶。
假阳性/假阴性
样本处理：避免溶血(血红蛋白>0.2mg/ml抑制HRP活性)。
抗体验证：通过Western Blot确认抗体特异性。
关键操作技巧
包被条件：4℃过夜包被优于37℃短时孵育，减少蛋白变性。
加样规范：枪头垂直悬空加液，距孔底2-3mm。
显色控制：TMB显色时间通常为10-30分钟，避免过度反应。
注：ELISA试剂盒需2-8℃保存，避免反复冻融;不同批次试剂禁止混用。
注意：以上仅供参考，不作为实际数据，实验需严格遵循说明或咨询技术老师。 Elisa试剂盒
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