miRNA荧光定量PCR试剂盒的使用步骤

　　miRNA荧光定量PCR试剂盒的使用步骤

　　miRNA荧光定量PCR试剂盒的使用步骤主要基于TaqMan探针法技术，其核心流程包括样本准备、反应体系配置、扩增及数据分析。以下是具体操作步骤及注意事项：

　　1. ‌样本准备‌

　　RNA提取‌：使用Trizol法或商业试剂盒提取总RNA，需确保RNA完整性(RIN值>7)‌。

　　反转录‌：采用茎环引物或poly(A)加尾法将miRNA反转录为cDNA，推荐使用特异性反转录酶(如M-MLV)‌。

　　2. ‌反应体系配置‌

　　试剂组分‌：预混液包含TaqMan探针(标记FAM/VIC染料)、引物对及UNG酶(防污染)‌。

　　加样顺序‌：按以下比例配制20μL体系：

　　cDNA模板 2μL

　　TaqMan预混液 10μL

　　引物/探针混合液 1μL

　　RNase-free水补足至20μL‌。

　　荧光定量PCR的应用

　　配置反应体系

　　荧光定量PCR的临床诊断意义

　　扩增情况与PCR控制

　　非特异性扩增与污染问题

　　仪器校准和标准化操作

　　3. ‌扩增程序‌

　　循环参数‌：

　　预变性：95℃ 10分钟

　　扩增：95℃ 15秒 → 60℃ 1分钟(40循环)‌。

　　内参选择‌：推荐使用U6 snRNA或miR-16作为内参，校正样本间差异‌。

　　4. ‌数据分析‌

　　定量方法‌：采用ΔΔCt法计算miRNA相对表达量，需标准品绘制标准曲线‌。

　　质量控制‌：阴性对照(无模板)和阳性对照(已知浓度miRNA)需同步检测‌。

　　注意事项

　　探针设计‌：确保探针长度≤30bp，Tm值比引物高10℃，避免G连续重复‌。

　　污染防控‌：使用UNG酶防止气溶胶污染，操作分区进行‌。

　　注意：以上仅供参考，不作为实际数据，实验需严格遵循说明或咨询技术老师。 Elisa试剂盒

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