抗体常见问题之WB解决方案

　　抗体常见问题之WB解决方案  天津天正信达  Elisa试剂盒

　　1. 条带位置异常

　　原因‌：蛋白可能存在多种异构体(如剪切体、二聚体)或翻译后修饰(如糖基化、泛素化)‌。重组蛋白与内源蛋白的修饰差异也会导致偏移。

　　解决‌：查阅UniProt等数据库确认蛋白异构体信息，或使用磷酸酶实验验证修饰影响‌。

　　2. 信号弱或无信号

　　原因‌：转膜不充分、抗体浓度不足、样本蛋白量低或封闭不干净‌。

　　解决‌：

　　增加上样量(每泳道≥20μg)或浓缩样本。

　　延长一抗孵育时间(4℃过夜)，提高抗体浓度。

　　检查转膜效率(如PVDF膜需甲醇激活)。

　　3. 背景过高

　　原因‌：抗体非特异性结合、封闭不足或洗涤不充分‌。

　　解决‌：

　　降低抗体浓度，增加洗涤次数。

　　使用5%脱脂奶粉或BSA充分封闭(37℃ 1小时或4℃过夜)。

　　避免使用含生物素的封闭物(如检测生物素标记蛋白)‌。

　　4. 杂带或多条带

　　原因‌：抗体特异性差、细胞传代过多或交叉反应‌。

　　解决‌：

　　选择有WB验证数据的抗体，避免使用重组蛋白验证数据‌。

　　使用低传代细胞(≤15代)并设置阳性对照。

　　突变磷酸化位点验证抗体特异性‌。

　　5. 其他关键问题

　　转膜失败‌：检查膜与凝胶对齐，排除气泡，调整电压/时间‌。

　　显色异常‌：现配ECL底物，避免曝光过度或底物失效‌。

　　注：以上仅供参考，不作为实际数据，实验需严格遵循说明或咨询技术老师。

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