如何正确使用RNA逆转录试剂盒?

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　　如您正在准备RNA实验，天正信达小编来帮你梳理一下逆转录试剂盒的正确使用步骤和关键细节：

　　一、实验前准备

　　RNA样本‌：确保RNA完整(28S/18S条带清晰，28S强度约为18S两倍)，避免降解(冰上操作，使用RNase-free耗材)。

　　试剂与耗材‌：准备逆转录酶、缓冲液、dNTPs、引物(Oligo dT或随机引物)及无RNA酶水。

　　二、操作步骤

　　去基因组DNA‌(可选)：

　　加入DNA酶(2μL)和无菌水至16μL，室温反应5分钟，冰上备用。

　　反应体系配制‌(冰上操作)：

　　按顺序加入RNA模板(1–5 μg)、引物(0.1–1 μM)、dNTPs(0.5–1 mM)、缓冲液和逆转录酶(1–20 U/μL)，补无RNA酶水至20–50 μL。

　　逆转录反应‌：

　　退火：25–37℃孵育5–10分钟。

　　延伸：42–50℃孵育30–60分钟。

　　终止：70–85℃加热5–10分钟。

　　产物处理‌：

　　立即冰浴，cDNA可-20℃/-80℃保存。

　　三、注意事项

　　防降解‌：全程冰上操作，使用RNase抑制剂。

　　引物选择‌：

　　Oligo dT：特异性高，需完整mRNA。

　　随机引物：适用性广，但片段短。

　　gDNA污染‌：使用带gDNA去除功能的试剂盒。

　　四、常见问题

　　RNA降解‌：检查电泳条带，避免反复冻融。

　　引物设计‌：避免gDNA扩增，或使用DNase I处理。

　　注：以上仅供参考，本试剂仅供科研使用，不作为实际数据，实验需严格遵循说明或咨询技术老师。

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