ELISA试剂盒竞争法操作的步骤与注意事项

　　ELISA试剂盒竞争法操作的步骤与注意事项

　　以下是ELISA竞争法操作的标准化步骤及关键注意事项，结合实验规范与常见问题解决方案整理：

　　一、操作步骤‌

　　试剂与样本准备‌

　　标准品按说明书要求进行倍比稀释(如5倍梯度稀释)，避免涡旋震荡导致蛋白变性‌。

　　样本需离心澄清(10,000×g 5分钟)，避免溶血或细菌污染干扰结果‌。

　　竞争反应‌

　　将样本与预稀释的特异性抗体工作液混合(抗体仅识别目标抗原)，37℃孵育1小时‌。

　　孵育时覆盖封板膜，防止蒸发和温度不均‌。

　　洗涤与酶结合‌

　　洗板3次(含0.05% Tween-20的洗涤液)，去除未结合物质‌。

　　酶结合物工作液需现配现用(15分钟内使用)，37℃孵育50分钟‌。

　　显色与读数‌

　　加入TMB底物避光反应20分钟，终止液需在5分钟内加入并读数(450nm波长)‌。

　　二、关键注意事项‌

　　加样规范‌

　　枪头悬空加至孔底，避免触碰孔壁或产生气泡‌。

　　复孔加样需控制时间差(≤5分钟)，减少操作误差‌。

　　显色异常处理‌

　　无显色‌：检查底物是否避光保存或酶标抗体是否失效‌。

　　高背景‌：增加封闭时间(1-2小时)或洗涤次数(≥5次)‌。

　　假阳性/假阴性控制‌

　　溶血样本需离心处理，类风湿因子阳性样本添加RF阻断剂‌。

　　竞争法需严格按“样本+抗体→酶标物"顺序操作，避免顺序错误导致假阴性‌。

　　三、扩展资源‌

　　注：不同品牌试剂盒参数可能差异较大，建议以实际说明书为准。

　　注：以上仅供参考，不作为实际数据，实验需严格遵循说明或咨询技术老师。 ELISA试剂盒

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