Elisa试剂实验技能要点及常见问题解析

　　Elisa试剂实验技能要点及常见问题解析

　　ELISA实验核心技能要点 天正信达生物

　　一、实验前准备

　　试剂与样本处理‌

　　试剂平衡至室温(20-25℃)30分钟，避免冷凝水影响反应‌

　　样本分装保存于-80℃，避免反复冻融，溶血/脂血样本需离心处理‌

　　粉末标准品需涡旋溶解后静置10-30分钟，确保溶解‌

　　设备校准‌

　　移液器定期校准(尤其小体积加样)，酶标仪预热10-15分钟‌

　　恒温箱温度控制在37℃±0.5℃，避免边缘效应‌

　　二、关键操作步骤

　　加样与孵育‌

　　加样前混匀样本，避免气泡，枪头贴壁加样减少误差‌

　　震荡孵育(300 rpm)可提高反应效率，37℃孵育时间需严格统一‌

　　洗涤与封闭‌

　　手工洗板时垂直拍板，避免交叉污染，扣干后立即加液‌

　　封闭液推荐5% BSA或脱脂牛奶，封闭时间≥30分钟‌

　　显色与终止‌

　　底物避光孵育(TMB显色10-15分钟)，终止液需及时添加‌

　　终止后30分钟内完成读数，避免信号漂移‌

　　常见问题及解决方案

　　一、标准曲线异常

　　线性差(R²<0.99)‌：检查标准品稀释梯度，避免孔间污染‌

　　梯度不明显‌：确认酶标仪波长校准(450 nm/630 nm)‌

　　二、高背景信号

　　封闭不充分‌：延长封闭时间或更换封闭剂(如5% BSA)‌

　　洗涤不净：增加洗涤次数(5次)，每次注满洗涤液浸泡30秒‌

　　三、重复性差

　　加样误差‌：使用多通道移液器，同步操作复孔‌

　　孵育条件波动‌：恒温箱加盖，避免蒸发和温度不均‌

　　四、灵敏度不足

　　显色淡‌：延长底物孵育时间(预实验优化)‌

　　信号弱‌：检查抗体效价，避免试剂过期或酶失活‌

　　数据判读标准

　　OD值范围‌

　　空白孔OD<0.2，标准品最高浓度孔OD>1.0‌

　　样本OD值需落在标准曲线范围内，超出需稀释重测‌

　　质控指标‌

　　标准品CV%<8%，样本CV%<20%‌

　　加标回收率80-120%为合格‌

　　优化建议

　　预实验设计‌：通过抗体滴定确定最佳工作浓度‌

　　环境控制‌：显色过程严格避光，温育过程减少开盖‌

　　质控对照‌：每板设置阴阳性对照，验证试剂活性

　　注意：以上仅供参考，不作为实际数据，实验需严格遵循说明或咨询技术老师。 Elisa试剂盒

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