ELISA实验步骤优化与关键要点解析
以下是ELISA实验步骤优化与关键要点的专业解析，天正信达结合资源整理：
一、实验前优化要点
包被条件优化
抗原/抗体浓度需通过棋盘滴定法确定(通常1-10 μg/mL)，碳酸盐缓冲液(pH 9.6)包被效果优于PBS
包被时间：4℃过夜(16-18小时)或37℃ 2小时，确保固相载体表面覆盖
封闭剂选择
推荐5% BSA或脱脂奶粉，封闭时间1-2小时，可减少非特异性结合
含吐温20的PBS(0.05%)可降低疏水相互作用干扰
二、实验操作关键控制
加样技术
标准品需2倍梯度稀释(建议8个浓度点)，每孔加样量50μL，避免气泡产生
样本与标准品加样间隔不超过15分钟，37℃孵育时间控制在30-60分钟
洗涤规范
每孔洗涤液量300μL，浸泡时间1-2分钟，拍干时避免残留液体
洗涤次数需验证(通常3-5次)，过度洗涤可能导致信号丢失
三、显色与数据分析
显色反应控制
TMB底物避光孵育5-30分钟(需预实验确定)，终止液加入后15分钟内读数
双波长检测(450nm/630nm)可消除微孔板光学干扰
标准曲线要求
四参数逻辑回归拟合，R²需>0.99，样本OD值应在曲线线性范围内
阳性判定：样本OD值>阴性对照均值+3倍标准差
常见问题解决方案
高背景：增加洗涤次数或更换封闭液，检查抗体交叉反应性
信号弱：优化包被浓度或延长孵育时间，验证酶标抗体活性
标准曲线异常：检查标准品溶解状态，避免反复冻融
注：以上仅供参考，不作为实际数据，实验需严格遵循说明或咨询技术老师。 Elisa试剂盒
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